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Além dos projetos na área de desenvolvimento de fármacos cardiovasculares (LipoCardium), programas de treinamento físico voltados a pacientes HIV/AIDS (Cuide-se em Forma) e do PROICEM, o nosso laboratório mantém pesquisas voltadas à terapia do câncer e ao estudo da produção de proteínas de choque térmico (HSPs) em várias situações, incluindo no exercício físico. A seguir, encontram-se as propostas mais importantes relacionadas a estas outras áreas de investigação.

» EXPRESSÃO DA BOMBA GS-X/MRP1 EM LINFÓCITOS E CÉLULAS TUMORAIS NO CÂNCER

» PAPEL DA MRP1/BOMBA GS-X NA REGULAÇÃO DO POTENCIAL REDOX CELULAR E A INFLUÊNCIA DO ESTADO REDOX CELULAR NA EXPRESSÃO DA MRP1/BOMBA GSX

» ANÁLISE DE PERFORMANCE, EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO E ESTRESSE OXIDATIVO INDUZIDOS PELO TREINAMENTO FÍSICO DE MUSCULAÇÃO, E SUA REPERCUSSÃO NO PERFIL IMUNOLÓGICO

» MECANISMO DE INDUÇÃO DE PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO (HSP) PELO EXERCÍCIO FÍSICO DE RESISTÊNCIA: POSSÍVEL MODULAÇÃO PELO ÓXIDO NÍTRICO

EXPRESSÃO DA BOMBA GS-X/MRP1 EM LINFÓCITOS E CÉLULAS...

EXPRESSÃO DA BOMBA GS-X/MRP1 EM LINFÓCITOS E CÉLULAS TUMORAIS NO CÂNCER

A figura mostra o metabolismo das prostaglandinas ciclopentenônicas (CP-PGs) a partir de PGs parentais.Uma complicação severa observada em pacientes terminais de câncer é a imunossupressão. Por outro lado, estudos de nosso grupo sugerem que a superprodução de prostaglandinas (PGs) e sua interconversão em PGs ciclopentenônicas (CP-PGs) no plasma de indivíduos portadores de câncer possam contribuir para o quadro de depressão imunológica. Os resultados destes trabalhos mostraram que tecidos linfóides de ratos portadores do tumor de Walker 256 acumulam grandes quantidades de CP-PGs, substâncias altamente citotóxicas e citostáticas, capazes de desarmar eficientemente a resposta imunológica dos animais quando em altas concentrações. Ao contrário dos tecidos imunológicos, o tecido tumoral destes animais virtualmente não acumula CP-PGs, ficando livre dos efeitos destes eicosanóides.




ESTÁGIOS INICIAIS.                        Representação esquemática da      interconversão de prostaglandinas no plasma de animais com câncer. No estágio inicial da doença, tumores e células apresentadoras de antígenos, especialmente macrófagos, produzem grandes quantidades de PGE2 e PGD2 que podem ser transformadas enzimaticamente no plasma dos animais portadores de tumores em PGA2 e Δ12-PGJ2, respectivamente. No esquema, B representa linfócitos B; T, linfócitos T; Th, células T auxiliares; Tc, células T citotóxicas; NK, células "natural killer" ou matadoras naturais; IFN, interferon; IL, interleucina. Referências: (a) Urade et alii, 1989; (b) Ito et alii, 1989; (c) Williams et alii, 1968; (d) Williams &Siddiqui et alii, 1990; (e) Scott et alii, 1982; (f) Ohno et alii, 1986; (g) Kikawa et alii, 1984. ESTÁGIOS FINAIS. Esquema do efeito imunossupressor de prostaglandinas ciclopentenônicas no câncer. Nos estágios finais do câncer, as prostaglandinas ciclopentenônicas (CP-PGs) PGA2 e Δ12 PGJ2, presentes em altas concentrações no plasma dos animais portadores de tumores, são captadas por células do sistema imunológico através de transportadores específicos. Após captação, as CP-PGs ligam-se aos núcleos destas células impedindo a progressão do ciclo celular além da fase G0/G1. Além disso, estas prostaglandinas apresentam uma série de outros efeitos deletérios sobre a resposta imunológica o que favorece o crescimento do tumor. No esquema, B representa linfócitos B; T, linfócitos T; Th, células T auxiliares; Tc, células T citotóxicas; NK, células "natural killer" ou matadoras naturais; IFN, interferon; IL, interleucina. Referências: (h) Yurochko et alii, 1990; (i) Leung & Mihichi, 1980; (j) Phipps et alii, 1989; (l) Jakob et alii, 1990; (m) Petrini et alii, 1988; (n) Pelus et alii, 1988.
Localização e funcionamento da bomba GS-X/MRP1. A ATPase de S-conjugados de glutationa ou bomba GS-X localiza-se, pelo menos em todas as células até então testadas, na membrana plasmática das mesmas e exporta substâncias eletrofílicas (X) para o extracelular após a conjugação das mesmas com moléculas de glutationa (GSH), o que se dá no citoplasma pela ação das glutationa S-transferases.

Na verdade, os nossos resultados e os de alguns outros centros de pesquisa indicam que células tumorais apresentam diferentes sensibilidades ao tratamento com CP-PGs devido à expressão de uma ATPase de membrana, a bomba GS-X/MRP1, que exporta S-conjugados de glutationa (GSH) com substâncias hidrofóbicas com caráter eletrofílico, como as CP-PGs. Resultados deste laboratório indicaram que a atividade da bomba GS-X, codificada pelo gene de resistência múltipla a drogas (multidrug resistance-associated protein, MRP1) é elevada em vários tipos de cânceres humanos enquanto que células imunológicas apresentam atividade muito baixa. Além disso, nossos estudos revelaram que a atividade da bomba GS-X/MRP1 em linfócitos é, na verdade, praticamente indetectável, o que impediria a extrusão de CP-PGs produzidas em grandes quantidades no plasma de animais com câncer. Portanto, além de causar resistência ao tratamento com quimioterápicos anticâncer, a baixa atividade da bomba GS-X/MRP1 em linfócitos, mesmo estimulados mitogenicamente, poderia contribuir para o acúmulo de CP-PGs levando à imunossupressão.

Os tratamentos quimioterápicos convencionais enfrentam o grande empecilho da resistência tumoral devido à expressão da bomba GS-X/MRP1 por vários tipos de câncer. Por isso, inúmeros estudos têm sido desenvolvidos nos últimos anos no sentido de se "desligar" a expressão do gene MRP1 ou bloquear a atividade de seu produto (bomba GS-X) em células tumorais. No entanto, a inabilidade de células imunológicas de expressar a bomba GS-X/MRP1 em níveis compatíveis com as altas atividades detectadas em tumores sólidos não havia sido estudada. Assim, passamos a investigar os efeitos da transfusão de linfócitos transfectados com o gene da bomba GS-X/MRP1 sobre o crescimento tumoral, quadro metabólico geral e desenvolvimento de caquexia em ratos portadores do tumor de Walker 256. Os resultados dos primeiros anos desse estudo indicam que a transfecção de linfócitos com o gene da bomba GS-X/MRP1 leva a um grande incremento na resistência ao tratamento com CP-PGs. Nossa expectativa é que, com o restabelecimento da funcionalidade de linfócitos, o sistema imunológico como um todo deva apresentar melhor desempenho frente ao crescimento tumoral, utilizando-se de seu arsenal imunológico natural, com conseqüente redução da caquexia e da taxa de crescimento do tumor sem a necessidade de utilização de quimioterapia pesada.

Impacto da produção de prostaglandinas ciclopentenônicas (CP-PGs) sobre o sistema imunológico de indivíduos com câncer. (a) Células tumorais bem como células apresentadoras de antígenos estimuladas pela presença do tumor produzem grandes quantidades de prostaglandinas do tipo E e D, que podem ser (b) convertidas em CP-PGs no sangue do portador do tumor. (c) Uma vez no plasma, as CP-PGs são prontamente captadas pelos linfócitos onde causam dramáticas alterações na fisiologia destas células levando (d) à imunossupressão. Na ausência de uma resposta imunológica eficiente, as células tumorais são favorecidas e podem proliferar-se livremente nos estágios finais da doença (e). Ao contrário do observado em linfócitos, células de muitos tipos de tumores (particularmente os sólidos) tendem a expressar fortemente a ATPase MRP/bomba GS-X, que tem a capacidade de eliminar as CP-PGs para o espaço extracelular na forma de GS-conjugados ficando livres dos efeitos citostáticos e citotóxicos destas PGs.

A expressão da MRP/bomba GS-X pode ser um importante agente de modulação da atividade biológica das CP-PGs, através da exportação das mesmas para o espaço extracelular. O papel fisiológico destas proteínas pode variar de uma função protetora contra a toxicidade química e estresse oxidativo (COLE & DEELEY, 1998) à regulação do estado redox e de ativação celular (HOMEM de BITTENCOURT et alii, 1998 a, b) bem como à supressão do crescimento celular no câncer (ISHIKAWA et alii, 1998). O entendimento da regulação da expressão dos genes que codificam para a MRP/bomba GS-X, será, portanto, um passo importante na elucidação de novos padrões de resistência múltipla a drogas anticâncer (MDR) e controle de proliferação celular já que poderá proporcionar informação significativa acerca de estratégias a serem empregadas na prática quimioterápica no câncer.

Paralelamente à manipulação da MRP1/bomba GS-X em células tumorais, contudo, este laboratório propõe o uso de linfócitos transfectados com a MRP/bomba GS-X do sangue de pacientes de câncer com a finalidade de transfusão autóloga [veja, por favor, a figura abaixo para proposta de terapia com linfócitos transfectados com a MRP/bomba GS-X (MTL)]. Esta possibilidade está, atualmente, sob investigação em nosso grupo de pesquisa através do uso da transfecção do gene MRP1 em linfócitos de ratos portadores do TW256. No entanto, a quantidade de linfócitos que pode ser obtida através deste processo pode significar apenas uma pequena parcela do volume total de linfócitos existentes no organismo. Além disso, o sucesso da transfecção do gene MRP nestas células pode ocorrer somente em uma minoria dos linfócitos coletados. Então sugere-se um método alternativo de transfecção de linfócitos, o qual está baseado na abordagem de um adeno-retrovírus quimérico (para revisão veja REYNOLDS et alii, 1999, por favor). Esta técnica é utilizada para melhorar a incorporação de genes heterólogos em genomas hospedeiros de forma estável (integração gênica) de maneira a prolongar a expressão do gene.

Desta forma, este grupo está investigando a preparação de quimeras adeno-retrovirais, através da incorporação de seqüências específicas de DNA da região inicial (E1) dos vetores adenovirais (figura a seguir), como já descrito por REYNOLDS (1999). DNA contendo genes codificando para funções de empacotamento retroviral (e.g. a protease essencial gag, transcriptase reversa pol, e proteína anfotrópica de envelope env) e genes codificando para proteínas direcionadoras do vírus para o marcador de linfócitos CD4 são incorporados em um vetor adenoviral sob o controle do promotor/enhancer do citomegalovirus (CMV). De outro lado, um vetor adenoviral carregando funções de vetor retroviral é preparado de tal forma a conter os genes para rersistência à neomicina (Neor), proteína fluorescente verde (GFP - do Inglês, green fluorescent protein) e a MRP/bomba GS-X flanqueada pelas repetições terminais longas retrovirais (LTRs) e pelo sinal de empacotamento retroviral (Ψ). Então, partículas adeno-retrovrais podem ser produzidas em células-alvo transientes, através da infecção destas células intermediárias com uma combinação de ambos os construtos virais. A progenia quimérica produzida pelas células intermediárias pode, então, ser usada para infectar linfócitos in vivo, de maneira a levar a uma integração gênica estável com possível transferência do gene da MRP/bomba GS-X para a progenia dos linfócitos quando estes se proliferarem.

Adeno-retrovírus quiméricos têm a propriedade de absorver as características mais vantajosas de ambos os vírus, tais como alta infectividade in vivo, produção de altos títulos e capacidade de infecção de células divisíveis e não-divisíveis dos adenovirus, associadas a peculiaridades próprias de vetores retrovirais, como expressão prolongada dos genes expressos e fácil integração gênica, que permitem que os genes liberados pelos retrovírus possam ser transmitidos para as células-filhas das células infectadas por muitas gerações. Assim, se espera obter uma nova forma de tratamento para pacientes terminais de câncer, a saber, a liberação direta, in vivo, dos genes da MRP/bomba GS-X para os linfócitos destes indivíduos. Visto que uma das maiores ameaças ao sucesso do tratamento de pacientes com câncer em estágios avançados é a imunossupressão apresentada pelos mesmos e que pode ser, ao menos parcialmente, devida ao acúmulo de CP-PGs nos tecidos imunológicos, a estratégia proposta poderá desbloquear a resposta imunológica. Através da eliminação de CP-PGs, que são extremamente citotóxicas e citostáticas quando em altas concentrações em linfócitos, por intermédio da MRP/bomba GS-X, espera-se que uma nova abordagem clínica possa tornar-se acessível, na qual as armas biológicas contra as células cancerosas serão o retorno da própria função imunológica a sua normalidade.

Proposta para terapia gênica pela transfecção in vitro de linfócitos com o gene MRP/bomba GS-X. A superprodução de prostaglandinas ciclopentenônicas (CP-PGs), que são extremamente citotóxicas e citostáticas quando em altas concentrações, podem levar à imunossupressão nos estágios finais do câncer. Enquanto o tecido tumoral consegue livrar-se das CP-PGs exportando-as para o espaço extracelular na forma de GS-conjugados de glutationa através da MRP1/bomba GS-X, linfócitos não exibem nenhuma atividade apreciável desta ATPase e, portanto, acumulam CP-PGs. A possibilidade de reversão do processo de imunossupressão mediado por CP-PGs está sendo investigada em nosso laboratório utilizando-se do TW256 como modelo em ratos conforme descrito a seguir. Depois de o tumor alcançar a fase de crescimento rápido, amostras de sangue são coletadas [1], linfócitos são separados, transfectados in vitro [2] e reinjetados nos animais [3]. Espera-se que, após o tratamento, os linfócitos possam exportar CP-PGs através da MRP1/bomba GS-X. Na ausência das CP-PGs, que são imunobloqueadoras, os linfócitos poderão proliferar-se restabelecendo a função imunológica e impedindo o crescimento tumoral [4].
Proposta para a preparação e utilização de quimeras adeno-retrovirais através da incorporação de seqüências específicas na região inicial (E1) de um vetor adenoviral in vivo. (A) Genes contendo funções de empacotamento de DNA retroviral (protease essencial gag, transcriptase reversa pol, e envelope amfotrópico env) e genes para proteínas direcionadas ao receptor CD4+ de linfócitos T são incorporados em um vetor adenoviral sob o controle do promotor/enhancer inicial intermediário do citomegalovírus (CMV). (B) Um vetor adenoviral compreendendo funções retrovirais como os genes para a resistência à neomicina codificadas (Neor), green fluorescent protein (GFP) e para MRP1/bomba GS-X flanqueados pelas seqüências de longas repetições terminais (LTR) retrovirais e pelo sinal de empacotamento (Ψ). Células produtoras de retrovirus transientes são convertidas pela transfecção com uma combinação de ambos os construtos virais. A progenia quimérica é então usada para infectar linfócitos in vivo de maneira a se estabelecer uma integração gênica estável.

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PAPEL DA MRP1/BOMBA GS-X NA REGULAÇÃO DO POTENCIAL REDOX...

PAPEL DA MRP1/BOMBA GS-X NA REGULAÇÃO DO POTENCIAL REDOX CELULAR E A INFLUÊNCIA DO ESTADO REDOX CELULAR NA EXPRESSÃO DA MRP1/BOMBA GSX

A relação oxidação-redução, ou estado "redox" celular é fator significativo para a manutenção e defesa das células. O estado redox intracelular é um parâmetro preciso que permite às células uma eficiente habilidade de contra-atacar o meio extracelular altamente oxidante. A homeostase do estado redox intracelular é regulada por moléculas contendo grupamentos tióis livres, do tipo glutationa e tiorredoxina. Funções celulares essenciais, como a expressão de genes, são influenciadas pelo equilíbrio entre condições pró e anti-oxidantes. O mecanismo pelo qual a transcrição de genes específicos é regulada pelo estado redox em células eucarióticas é bastante complexo, porém, pesquisas recentes sugerem que fatores de transcrição sensíveis ao estado redox têm papel importante neste processo (ARRIGO, 1999).

Cascatas de sinalização ativadas por estresse oxidativo são afetadas por alterações no potencial redox intracelular. As espécies reativas de oxigênio (ROS, do Inglês Reactive Oxygen Species), formadas, na maioria dos casos, por agentes genotóxicos exógenos (irradiação, citocinas inflamatórias e carcinógenos), são elementos desencadeadores das alterações do potencial redox. As ROS e o potencial redox alterado podem ser considerados como as mudanças intracelulares primárias que regulam proteínas-quinase, servindo, deste modo, como importantes componentes celulares de ligação entre o estímulo externo e o sinal de transdução na resposta ao estresse (ADLER et alii, 1999). Em contraste à noção convencional de que as ROS sejam primordialmente um gatilho para o dano oxidativo das estruturas biológicas, está o fato de que, em baixas concentrações (fisiológicas), estas possam regular uma série de mecanismos moleculares que podem estar ligados a importantes funções celulares (SEN, 2000).

O potencial redox é sustentado pela relação entre todos os pares redox intracelulares, cujas semi-reações encontram-se em equilíbrio. Como a glutationa (GSH) e sua forma oxidada, o dissulfeto de glutationa (GSSG), constituem um elo de ligação entre todas as reações de oxirredução intracelulares e apresentam-se em altas concentrações dentro das células, o status do par GSH-GSSG é considerado como um índice do estado redox das células. Até por isso, a maioria das reações destoxificantes ligadas ao estresse oxidativo está ligada de alguma forma ao metabolismo da GSH, sendo que este é finamente regulado nas células sob condições normais e de estresse. Nestas condições, a extrusão de GSH e conjugados de GSH (GS-conjugados), para fora das células é parte do sistema GSH de defesa celular contra ROS. A redução de hidroperóxidos pela enzima GSH peroxidase (GSPx) produz GSSG, o qual é transportado através da membrana celular por intermédio de uma ATPase específica para GS-conjugados (AKERBOOM & SIES, 1994). A magnitude da resposta a estímulos fisiológicos, suficientemente intensos para disparar a sinalização redox sob condições não tóxicas, no entanto, ainda não é conhecida.

TOYOKUNI et alii (1995) sugeriram que diversas linhagens tumorais parecem apresentar um persistente estado de estresse oxidativo, o qual poderia ocasionar, entre outros eventos, a ativação intermitente de fatores de transcrição, tais como NF-κB (do Inglês, nuclear factor-kappaB), e induzir a expressão de proto-oncogenes, tais como c-fos, c-jun e c-myc. O estresse oxidativo, também induz danos ao DNA, como produtos modificados das bases e quebra da fita que podem levar à mutação e aberração mutacional (instabilidade genômica). Apesar de estar sob constante microambiente oxidativo, as células tumorais aparentemente são resistentes à citólise oxidante, e adenocarcinomas, em geral, são altamente resistentes à quimioterapia, particularmente, ao tratamento com agentes eletrofílicos. Portanto, estes resultados sugerem que células tumorais devam apresentar um mecanismo para resistir ao estresse oxidativo gerado por ROS e agentes eletrofílicos, como a produção aumentada de fatores derivados da células T da leucemia adulta (ADF, do Inglês adult T-cell-leukemia-derived factor), GSH e da enzima glutationa S-transferase (GST) (TOYOKUNI et alii, 1995).

Estudos recentes de nosso grupo demonstraram que, em associação às condições referidas por estes autores (TOYOKUNI et alii, 1995), a presença da ATPase de membrana MRP/bomba GS-X, que exporta GS-conjugados, possa estar envolvida na resistência de células tumorais à atividade antiproliferativa ocasionada pela presença de prostaglandinas ciclopentenônicas (CP-PGs). As CP-PGs (eletrofílicas) conjugam-se com GSH através da GST, produzindo um GS-conjugado. Tendo em vista que a reação da GST encontra-se próxima do equilíbrio químico sob as condições fisiológicas do meio intracelular, a MRP/bomba GS-X desloca o equilíbrio para a direita, no sentido da formação de mais GS-conjugados, o que impede o acúmulo de eletrófilos, como as CP-PGs. Logo, a ausência, ou baixa atividade da MRP/bomba GSX permite o acúmulo destas CP-PGs as quais têm reconhecida atividade antiproliferativa, situação que se observa nos linfócitos em pacientes e animais com câncer. No entanto, em células tumorais, com a alta atividade da MRP/bomba GS-X, estes conjugados são exportados para o meio extracelular, permitindo nova conjugação, o que impede o acúmulo das CP-PGs. A expressão da GST (que é induzida pela ativação do fator de transcrição AP-1, dependente do NF-κB) também se apresenta aumentada no câncer e no soro de pacientes com câncer, é induzida por estresse oxidativo e está associada com a resistência das células tumorais a agentes quimioterápicos (TOYOKUNI et alii, 1995).

A presença do câncer é uma situação de estresse que leva a um desbalanço redox intracelular. Este desequilíbrio dá-se tanto pelo aumento de espécies oxidantes, com conseqüente aumento das concentrações intracelulares de GSSG, quanto pela depleção não-oxidativa da GSH, através da formação de GS-conjugados. Nestas situações verifica-se a expressão de proteínas de choque térmico (HSP, do Inglês, Heat Shock Proteins), associadas ao estado redox alterado (HOMEM de BITTENCOURT et alii, 1998a,b,c). A homeostase do redox intracelular de GSH é finamente regulada para comandar o metabolismo celular e proteger as células contra o estresse oxidativo. As HSPs, inicialmente descritas como proteínas expressas em resposta ao estresse térmico, são fundamentais para a proteção das células contra vários tipos de estresse e na recuperação das mesmas do efeito tóxico do calor e outros estresses (RIABOWOL, MIZZEN & WELCH, 1988). KONDO et alii (1993) sugeriram que a síntese de GSH, através da glutamilcisteínasintetase (γ-GCS, enzima-chave de regulação da síntese GSH) e o transporte de metabólitos de GSH são responsíveis ao choque térmico, verificando aumento da expressão de ambos os mRNAs, da γ-GCS e de HSPs. Outras evidências mostraram existir uma íntima relação entre a resposta celular ao estresse oxidativo e a atividade das HSPs. Por exemplo, o efeito citotóxico da ativação do NF-κB (fator de transcrição nuclear κB) pelo TNFα (fator de necrose tumoral alfa) em hepatócitos pode ser completamente revertido pela ativação da via das HSPs, enquanto que o bloqueio da expressão das mesmas pela utilização de mRNA anti-sense para a HSP reverte completamente o efeito citoprotetor do choque térmico. (KIM et alii1997). O tratamento de células com doadores de óxido nítrico (NO) leva à formação de GS-conjugados e conseqüente depleção dos conteúdos de GSH intracelular. Isto por sua vez, induz a ativação da via das HSPs (FEINSTEIN et alii, 1996; HUANG et alii, 1994) o que leva à citoproteção.

Evidências sugerem que os processos oxidativos celulares têm papel fundamental na resposta inflamatória, através da ativação de quinases de estresse (JNK, MAPK, p38) e fatores de transcrição sensíveis ao estado redox, como NF-κB e AP-1, os quais diferencialmente regulam os genes mediadores pró-inflamatórios e genes protetores antioxidantes tais como a γ-GCS, enzima-chave de regulação da síntese de GSH (RAHMAN, 2000). O fator de transcrição nuclear NF-κB tem papel proeminente na regulação gênica das respostas imunológica e inflamatória, apoptose e proliferação celular (GALTER et alii, 1994). Já é sabido, há quase uma década, que o NF-κB é um fator de transcrição sensível ao estado redox. Estudos identificaram que uma certa quantidade de GSSG é necessária para a indução da ativação do NF-κB e da translocação nuclear, enquanto o excesso de GSSG inibe a função do NF-κB em nível da ligação ao DNA (GALTER et alii 1994). As etapas sensíveis ao estado redox são comumente dependentes da natureza do ativador do NF-κB (JANSSEN-HEININGER et alii, 2000). Hiperóxia ou elevações das ROS causam a ubiquitinação e destruição das proteínas inibitórias (I-κB), liberando o NF-κB e permitindo que se ligue aos promotores dos genes-alvo. Em células, modelos animais e injúria aguda em pulmões de humanos, também a hiperóxia induz a expressão de múltiplas citocinas pró-inflamatórias através de mecanismos dependentes de NF-κB (D'ANGIO & FINKELSTEIN, 2000). Por outro lado, a atividade do NF-κB como ligante do DNA e fator de transcrição, é inibida por agentes oxidantes e potenciada por tióis (MIHM et alii 1995). Assim, percebe-se nitidamente que existe um "ótimo" de estado redox abaixo do qual, a ativação do NF-κB diminui e acima do mesmo, a ativação aumenta mas sua capacidade de ligação ao DNA diminui (GALTER, et alii, 1994).

Verifica-se que em células que apresentam resistência múltipla a drogas (MDR), a baixa expressão de MRP está associada à baixa expressão da γ-GCS, o que poderia sugerir participação da MRP na regulação da GSH. Porém, apesar de o mRNA da γ-GCS apresentar co-expressão com as MRP-1 e MRP-2, a expressão dos dois genes parece ser controlada independentemente (KUO et alii, 1998). Estudos de vários grupos de pesquisa (JEDLITSHKI et alii, 1994; HOMEM DE BITTENCOURT & CURI, 2001), sugerem que a MRP, mais do que qualquer outra proteína, é mediadora do transporte de S-conjugados de GSH dependente de ATP. Uma oxidação aumentada de GSH, catalisada pela GSPx leva a formação aumentada de GSSG, que é um GS-conjugado e, portanto, substrato para a ATP-dependente MRP/bomba GS-X, podendo ser exportado pela mesma. Estes resultados sugerem que a MRP/bomba GS-X possa atuar como moduladora do potencial redox celular ao exportar os GS-conjugados e regular o balanço entre GSSG e GSH.

Considerando-se que estudos de nosso grupo e de outros laboratórios mostram que a MRP-bomba GS-X é capaz de exportar GS-conjugados, como GSSG, é possível que a mesma participe da regulação do estado redox intracelular, uma vez sob a ação de promotores de estresse celular. Assim sendo, estamos investigando o papel da MRP/bomba GS-X, para a manutenção do estado redox, através do desafio com diversos agentes estressantes: xantina/xantina oxidase, peróxido de hidrogênio (H2O2), óxido nítrico (NO), prostaglandinas ciclopentenônicas (CP-PGs), ditioteitrol (DTT), beta-mercaptoetanol (βME), hemina e choque térmico, comparando-se com a atividade da bomba em células controle e células transfectadas com o gene MRP-1, (superexpressando a bomba). Além disso, estamos avaliando a expressão de HSP (mRNA e proteína), a atividade das enzimas glutationa S-transferase (GST), γ-glutamilcisteína sintetase (γ-GCS) e cálcio ATPase, a ativação do NF-κB (migração para o núcleo), a viabilidade celular (como índice de citotoxicidade) e fragmentos de DNA (como estimativa de apoptose).

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ANÁLISE DE PERFORMANCE, EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE CHOQUE...

ANÁLISE DE PERFORMANCE, EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO E ESTRESSE OXIDATIVO INDUZIDOS PELO TREINAMENTO FÍSICO DE MUSCULAÇÃO, E SUA REPERCUSSÃO NO PERFIL IMUNOLÓGICO

Proteínas de choque térmico (HSP) são proteínas expressas universalmente nas células sob condições de estresse, como choque térmico, privação de glicose e exposição a agentes indutores de estresse oxidativo, como espécies ativas do oxigênio. O exercício físico também é uma forma de estresse celular, uma vez que incrementa o metabolismo oxidativo e proporciona a geração de espécies ativas do oxigênio que podem causar lesão celular dependendo da intensidade e duração da atividade física. Estes fatos justificam a expressão de HSP, particularmente da família de 70 kDa (HSP70), no tecido muscular após o exercício físico. Já a adaptação ao exercício físico reduz a expressão de HSP70 no músculo enquanto que indivíduos treinados mostram redução na expressão de HSP70 em leucócitos circulantes. Tendo em vista que o exercício físico influencia na performance do sistema imunológico, estamos investigando o papel da expressão da HSP70 em leucócitos circulantes de indivíduos submetidos a diferentes tipos de exercício e a correlação entre a expressão da HSP70 e a funcionalidade do sistema imunológico. Pretendemos, também, traçar o possível paralelo entre a expressão da HSP em leucócitos e o estado de condicionamento físico. Considerando-se que o papel fisiológico destas proteínas de estresse não se encontra totalmente esclarecido, o estudo da expressão de HSP70 no exercício físico e suas implicações para a performance imunológica poderão trazer à luz uma série de pontos relacionados à resposta celular ao estresse. Tendo em vista que os efeitos do treinamento físico envolvem adaptação e conseqüente redução da expressão de HSP, e considerando-se que foi verificado que o treinamento físico em humanos reduz a expressão de HSP em leucócitos, é possível que a expressão de HSP sirva como marcador do condicionamento físico, bem como de monitorador da intensidade do trabalho objetivado. Além disso, como a expressão de HSP está associada à citoproteção e durante o treinamento físico parece ocorrer adaptação na expressão de HSP em leucócitos, é possível que a produção de HSP esteja relacionada às alterações na resposta imunológica, como observada em indivíduos treinados aerobiamente.

MECANISMO DE INDUÇÃO DE PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO...

MECANISMO DE INDUÇÃO DE PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO (HSP) PELO EXERCÍCIO FÍSICO DE RESISTÊNCIA: POSSÍVEL MODULAÇÃO PELO ÓXIDO NÍTRICO

O termo proteína de choque térmico (HSP) tem sido usado para um grupo de proteínas induzidas por calor (Locke and Noble, 1995) ou por outros desafios metabólicos (Welch, 1992). A indução dessas proteínas é fundamental nos processos de reparo que seguem diferentes tipos de danos e na prevenção da agregação de proteínas não-nativas, principal mecanismo através do qual as HSP conferem citoproteção (Santoro, 2000). A exposição prévia das células a condições estressantes, não-letais, pode suscitar a síntese de HSP e proteger contra os efeitos lesivos de novas exposições (Meyer e Da Silva, 1999). Uma vez que o exercício físico é capaz de proporcionar condições bastante semelhantes àquelas indutoras da síntese de HSP (Locke and Noble, 1995; Essig and Nosek, 1997; Fehrenbach and Niess, 1999) e que o treinamento de endurance, em ratos, aumenta a expressão basal de HSP70, HSP73 e HSP60 no músculo sóleo (Samelman 2000), é provável que a expressão de HSP esteja relacionada com a prevenção de desnaturação protéica por radicais livres, possível causa dos efeitos duradouros da fadiga de baixa freqüência (Essig and Nosek, 1997; Clanton, Zuo e Klawitter, 1999).

A formação de óxido nítrico (NO), assim como a expressão de óxido nítrico sintase (NOS), aumentam nas células musculares e no fluido intersticial durante o exercício (Radegran e Hellsten, 2000). O aumento da concentração de NO pode levar à formação de S-nitroso glutationa (SNOG), que reduz a concentração de glutationa (GSH) e aumenta a relação dissulfeto de glutationa/glutationa (GSSG/GSH), determinando estresse oxidativo. Este, por sua vez, está associado com a ativação do fator nuclear κB (NF-κB) e injúria tecidual (Feinstein et al., 1996). Por outro lado, o NO também induz a síntese de HSP (Veseley et al., 1998; Clanton, Zuo e Klawitter, 1999), associadas com citoproteção por inibição da ativação do NF-κB (Feinstein et al., 1996). Desta forma, é possível que a ativação do NF-κB seja outra explicação para a injúria muscular que pode ocorrer em resposta a diversos tipos de exercício, tais como os exaustivos de longa duração e os que envolvem contrações excêntricas (Clanton, Zuo e Klawitter, 1999). Portanto, a geração de NO durante o exercício pode desempenhar um duplo papel, a saber: induzir injúria tecidual ligada à ativação do NF-κB e; proteger contra a mesma pela indução de HSP que bloqueiam a ativação do primeiro, agindo como uma alça de retroalimentação negativa a fim de minimizar os efeitos deletérios da superativação deste fator nuclear. Por isso, estamos estudando o papel do NO no mecanismo de indução da HSP70, em resposta ao exercício agudo e ao treinamento. Para tanto, utilizamos ratos Wistar adultos machos, submetidos a treinamento de natação em tanque. O estudo está sendo desenvolvido em duas etapas: (1ª) exercício agudo e; (2ª) exercício crônico (treinamento por 1, 2 e 3 meses). Para a primeira etapa os animais são divididos em pares, aleatoriamente distribuídos em dois grupos (seis em cada grupo): Grupo exercício (nada até a exaustão); Grupo repouso (mantido na água, sem nadar, pelo mesmo tempo do par que nada até a exaustão). Após este procedimento os animais são sacrificados e os músculos gastrocnêmio, solear e extensor longo dos dedos, de ambas as patas, são cirurgicamente removidos e processados conforme metodologias consagradas em nosso laboratório (veja na página de Nossa Equipe). Para estudar o efeito do exercício crônico, será determinado inicialmente o tempo para exaustão dos animais. A seguir os animais são, aleatoriamente, distribuídos em dois grupos (18 animais em cada grupo): Grupo treinado (submetidos diariamente, cinco vezes por semana a uma sessão de treinamento de duração igual ao tempo de exaustão obtido no primeiro dia de natação) e Grupo sedentário (colocado no tanque pelo mesmo tempo que levou para alcançar a exaustão, mas sem nadar). Ao final do primeiro, segundo e terceiro mês, são sacrificados seis animais de cada grupo e os músculos gastrocnêmio, solear e extensor longo dos dedos, de ambas as patas, são removidos e processados para análise. Inicialmente, estamos determinando os efeitos do exercício sobre a produção de NO, a expressão de e/i/nNOS, síntese e estabilidade de RNA mensageiro (mRNA) codificando para estas enzimas, a expressão de HSP70 e a síntese e estabilidade do mRNA codificando para HSP70. Também estão sendo determinados os aspectos relacionados ao estado redox das células. Acreditamos que o entendimento do processo de indução da HSP70 contribuirá para uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na fadiga e recuperação.

 

acessos                                                                 

Laboratório de Fisiologia Celular - Departamento de Fisiologia
Instituto de Ciências Básicas da Saúde (ICBS) - Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS)
Rua Sarmento Leite, 500 - 2o. andar - Laboratório 02 - Centro - CEP 90.050-170 Porto Alegre, RS, Brasil

        Fone: (51) 33083151 | Fax: (51) 33084555 |  E-mail: fisiologia.celular@ufrgs.br 

 

ÚLTIMA ATUALIZAÇÃO: 09/01/2021.

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