Autofagia


Autofagia é um processo celular fisiológico para degradação e reciclagem de componentes do citosol e organelas celulares danificadas, para manutenção da homeostase celular em condições adversas como privação de nutrientes, presença de patógenos e toxinas. Porém, quando o processo ultrapassa um determinado limiar pode levar ao processo de morte autofágica ou morte celular programada tipo II. E este parece ser o mecanismo de ação de algumas drogas utilizadas na prática clínica oncogênica, como a temozolomida e a rapamicina.

Diversas propriedades e proteínas específicas tem sido utilizadas para quantificação do processo autofágico. Uma propriedade que se aproveita do mecanismo autofágico é o fato de os autofagossmos maduros e autofagolisossomos serem organelas ácidas. Assim, pode-se utilizar o corante fluorogênico acidotrópico Laranja de Acridina (do inglês Acridine Orange – AO) para marcar especificamente esses ambientes celulares: o AO cora o citoplasma e núcleo celulares com fluorescência verde e, quando em um ambiente ácido, sofre modificações físico-químicas e passa a emitir fluorescência vermelha. Logo, células verdes E com uma fluorescência vermelha elevada são caracterizadas como células realizando autofagia, podendo essa porcentagem ser determinada por citometria de fluxo.

Com relação às proteínas marcadoras de autofagia utiliza-se, entre outras, a proteína LC3 (cadeia leve 3 da proteína 1 associada a microtúbulos), uma proteína citosólica (LC3 na forma I – LC3-I) que sofre uma clivagem C-terminal quando um sinal pró-autofágico é percebido pela célula, sendo convertida, assim, à forma II (LC3-II). Esta, sofre modificações e passa a se localizar especificamente na membrana de autofagossomos. Pode-se transfectar uma célula com um plasmídeo contendo a seqüência da proteína GFP fusionada à sequencia da proteína LC3-I em N-terminal. Assim, a célula transfectada possui fluorescência verde citoplasmática em condições não pró-autofágicas, ao passo que, quando um sinal pró-autofágico é percebido pela célula, a proteína LC3-I é clivada e atracada à membrana dos autofagossomos, sendo estes visualizados como pontos verdes (do inglês, green dots) no citoplasma da célula, que representam a proteína de fusão LC3-GFP agrupada nos autofagossomos. Por fim, pode-se quantificar a porcentagem de células realizando o processo autofágico dentro de uma população celular em determinadas condições através da relação entre o número de células GFP+ E com pontos verdes citoplasmáticos e o número de células verdes total.


Protocolo para avaliação da autofagia

Quantificação de autofagia através do plasmídeo pEGFP-LC3


  1. Plaquear as células em uma densidade de 5 x 103 células/poço em placa de 96 poços
  2. Transfectar as células com o plasmídeo pEGFP-LC3 utilizando o protocolo de uso do laboratório (por ex., Lipofectamina®, Lipofectamina 2000®, SuperFact®, etc)
  3. Após a transfecção (24h) expor as células aos tratamentos/condições de interesse do estudo
  4. Após o tempo de tratamento de interesse, contar um mínimo de 100 células verdes (GFP+) por tratamento e, entre essas células, quais possuem vacúolos autofágicos no citoplasma (microscópio de fluorescência - aumento de 400x).
  5. Calcular a relação:

    N de células GFP+ E com pontos verdes /N de células GFP+ contadas

Células com mais do que 5 pontos LC3-GFP bem definidos são consideradas autofágicas.



Células transfectadas com LC3-GFP sem indução de autofagia (controle).


Células transfectadas com LC3-GFP tratadas com rapamicina 100nM por 24h.


Quantificação do processo autofágico utilizando Laranja de Acridina


  • Solução Laranja de Acridina (em H2O) - 100 ug/mL ou 500 ug/mL
  • 1ug/mL por 15 min à temperatura ambiente no escuro

    C1 x V1 = C2 x V2

    Exemplo: em placa de 24 poços (500uL/poço) a partir da solução 500ug/mL
    500 x V1 = 1 x 0,5 mL
    V1 = 1uL
  1. Plaquear as células na densidade desejada (em placa de 12 ou 24 poços, normalmente).
  2. Após tratar as células com o tratamento de interesse, adicionar o Laranja de Acridina na concentração final de 1ug/uL por poço por no mínimo 15min à temperatura ambiente.
    CUIDAR O VOLUME DO POÇO! Normalmente não ficam os 500uL adicionados no dia anterior.Ou ajustar o volume para 500uL ou medi r o volume em cada poço ou trocar o meio do poço imediatamente antes de incubar com o laranja de acridina.
  3. Observar as células no microscópio de fluorescência para avaliar a marcação e fotografar, se for o caso.
    Fotografar no VISÍVEL, fluorescência verde (toda a célula – citoplasma E núcleo) e fluorescência vermelha (apenas compartimentos ácidos da célula)





    Cuidar para não ficar muito tempo fotografando. O Laranja de Acridina é um pouco citotóxico e as células começam a ficar danificadas a partir de uns 45min de marcação.

  4. Tripsinizar bem as células e passar no citômetro de fluxo.
    A marcação com Laranja de Acridina pode ser realizada com células em suspensão, da mesma forma citada acima.

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1. Ajustar os eixos (X x Y) dos gráficos para FSC lin x SSC lin e gatear somente as células viáveis, excluindo o debrie celular, conforme figura ao lado:


2. Ajustar os eixos (X x Y) dos gráficos para green lin x red lin, gateando para o plot 1.
Ajustar o gate no grafico usando o controle sem autofagia (ou com autofagia basal) conforme figura ao lado. O ideal é inclinar o gate ao longo do eixo de inclinação da população.


3. Aplicar o gate para todas as amostras.
A figura ao lado mostra um tratamento que induziu muita autofagia, observado na população a direita do gate, considerando tanto a percentagem de eventos nesta população quanto a intensidade média desta população.