Criopreservação

         Após o nascimento do primeiro mamífero proveniente de um embrião previamente congelado (Whittingham, 1972), a criopreservação de embriões, gametas vem ocupando um lugar cada vez mais importante nas tecnologias de reprodução assistida. As primeiras gestações humanas alcançadas a partir da transferência de embriões previamente criopreservados datam de 1984. Em muitos centros de RAH as taxas de implantação e gestação após a transferência de embriões criopreservados se aproximam àquelas de embriões frescos. Fundamental para este sucesso é a escolha dos embriões a serem criopreservados e/ou transferidos após a criopreservação. Tem-se cada vez mais certeza de que a qualidade dos embriões determinará o sucesso do procedimento após o descongelamento ou re-aquecimento e transferência à paciente. A seleção dos embriões pode ser feita em dois momentos: antes e após a criopreservação evitando assim procedimentos desnecessários de criopreservação e de transferência de embriões cujas chances de implantação e gestação são muito reduzidas.
        Na atualidade, os dois métodos de criopreservação mais difundidos em biologia da reprodução são o congelamento lento e a vitrificação.

Congelamento lento de embriões


Figura 1: Pailletes adaptadas à seringa de insulina e haste mantenedoras das mesmas para colocação dentro da câmera de armazenamento.
         O congelamento lento pode ser considerado o método clássico de criopreservação de embriões, amplamente empregado nos centros de RAH em todo o mundo. Ele tem a vantagem de utilizar baixas concentrações de crioprotetores, agentes nos quais os embriões são imersos para a criopreservação e que, como o próprio nome indica, têm a função de diminuir os possíveis danos causados pelo procedimento. O protocolo de congelamento lento mais difundido e empregado utiliza o 1,2-propanodiol (PROH) como crioprotetor especialmente para os estádios iniciais do desenvolvimento embrionário. Soluções crioprotetoras contendo o crioprotetor em concentrações crescentes formando kits de congelamento são disponíveis comercialmente e seu uso é bastante simples. Após a exposição às soluções de forma seqüencial, obedecendo tempos de exposição recomendados pelo fabricante, os embriões são geralmente depositados em pailletes plásticas, juntamente com o a solução crioprotetora mais concentrada.
         Atualmente, o equipamento necessário para o congelamento lento encontra-se disponível comercialmente em diversas versões sendo automatizado de maneira que se pode determinar a velocidade de resfriamento, a partir da temperatura ambiente em que se encontram os embriões até a temperatura do nitrogênio líquido (-196ºC) e pausas necessárias como, por exemplo, para a indução da formação de cristais de gelo, que pode ser observada pelo exterior da paillete. Este
processo é de fundamental importância para o sucesso do congelamento lento e é chamado de seeding. O equipamento é resfriado pelo nitrogênio liquido, o qual é bombeado a partir de um tanque, para o interior de uma câmera onde existem suportes para acomodar as pailletes contendo os embriões.
         No momento do congelamento, os embriões são removidos do meio de cultivo e expostos a concentrações crescentes do crioprotetor sendo que na última delas (em geral 1,5 M PROH), eles são aspirados com o auxílio de uma seringa de insulina para o interior de uma paillete e transferidos para a câmera de armazenamento do equipamento de congelamento lento (Figuras 1 e 2). A queda da temperatura ocorre gradativamente até o momento da pausa para o seeding , quando encosta-se um fórceps resfriado em NLiq nas pailletes para a indução da formação de gelo. A seguir, a temperatura continua a cair lentamente (0,3ºC/mim) até uma temperatura pré-determinada (em geral –40ºC) após a qual ela cai mais bruscamente até atingir –180ºC. Neste momento, as pailletes são removidas da câmara do aparelho de congelamento para o interior de um recipiente contendo NLiq de onde são captadas e colocadas em grupos, de uma mesma paciente, no interior de um pequeno cilincro plástico, dito um tubete, aderido à uma haste metálica, a qual é então imersa no NLiq em recipientes cilíndricos metálicos dos botijões de armazenamento (Figura 3).
 
Figura 2:
Máquina Planer, pailletes e botijão de nitrogênio líquido.


Figura 3: Tubets imersos em nitrogênio líquido.

            O número de embriões a serem descongelados em um ciclo de transferência depende do número e da qualidade deles, quando do congelamento. Em geral, descongela-se um embrião por vez acessando-se a cada passo a ausência de lise dos blastômeros e degeneração dos mesmos até a última etapa do processo. Um embrião que sobreviveu bem ao congelamento apresenta pelo menos 50% de seus blastômeros intactos e assim deve-se constituir um grupo de embriões com características de viabilidade morfológicas satisfatórias para transferência imediata ou cultivo pra transferência posterior.
            O descongelamento pode ser realizado no dia anterior à transferência dos embriões ou no próprio dia. A preferência pelo descongelamento no dia anterior, se dá pelo fato de que a viabilidade embrionária pode ser acessada pelo desenvolvimento do embrião in vitro, após o descongelamento e cultivo por cerca de 12 horas. Assim, embriões que foram congelados no estágio de 4 células e atingem o estágio de 6 a 8 células, após descongelamento e cultivo têm um prognóstico de implantação e gestação melhor, quando comparado com aqueles que não apresentaram qualquer clivagem durante o período em cultivo, o que facilita a seleção dos mesmos no momento da transferência. Alguns grupos preferem realizar o descongelamento no dia da transferência, na verdade algumas poucas horas antes dela. O motivo para tal procedimento é o argumento de que embriões previamente criopreservados têm sua viabilidade diminuída em relação aos frescos e sujeita-los a um período de cultivo in vitro, só viria diminuir ainda mais sua capacidade de desenvolvimento, enquanto que, o útero materno é o melhor ambiente para desenvolvimento embrionário. Mesmo considerando este argumento válido, o problema que este procedimento encontra é que, desta forma, pode estar se transferindo embriões que não tem qualquer capacidade de desenvolvimento, diminuindo assim as taxas de gestação para embriões congelados.
            Para o descongelamento, o crioprotetor deve ser removido gradualmente, em geral utilizando duas-três soluções contendo concentrações decrescentes do crioprotetor (1,0 - 0,75 – 0,37M) em meio de cultivo. Atualmente, a grande maioria dos grupos utiliza kits comerciais contendo as soluções de descongelamento prontas para uso e utilizadas de forma seqüencial, semelhante ao descrito para o congelamento. Após identificar cuidadosamente o nome e dados da paciente, as pailletes são removidas dos tubetes onde estão agrupadas dentro do botijão de armazenamento e transferidas a um recipiente contendo NLiq. Deste, a paillete, em geral uma por vez,é exposta à temperatura ambiente com auxílio de uma pinça, por 20 segundos e imediatamente imersas em banho-maria a 27ºC por outros 20 segundos. A seguir a corta-se a extremidade do lado em que os embriões foram aspirados e com o auxílio de uma haste metálica, o tampão de algodão da extremidade oposta é empurrado de forma a excluir todo conteúdo líquido da paillete juntamente com o(s) embrião nela contido. Este processo pode ser feito diretamente na 1ª solução de descongelamento (SD) ou na porção lateral da placa contendo a solução de onde os embrião é então rapidamente capturado e imerso na 1ª solução de descongelamento. Após 5-10 minutos, dependendo do protocolo, o embrião é passado à 2ª e 3ª SD, obedecendo o mesmo tempo de exposição a cada passo. Por fim o embrião passa pelo meio de cultivo para duas lavagens e é analisado quanto seu numero de blastômeros intactos e deixado para cultivo por algumas horas, nas mesmas condições de cultivo descritas anteriormente (FIV). Como citado acima, embriões que apresentaram clivagem durante o cultivo devem ser preferencialmente selecionados para transferência.

Vitrificação de embriões
            A vitrificação é um método rápido, que não exige o emprego de aparelhos especiais, mas faz uso de altas concentrações de crioprotetores, o que pode ser prejudicial à viabilidade embrionária ou do gameta a ser criopreservado. Vitrificação, que literalmente significa “transformação em vidro” pode ser definida como a conversão de um sistema do estado fluido ao estado sólido, unicamente pelo aumento de viscosidade, sem qualquer alteração de fase ou cristalização da água e, portanto, em completa ausência de gelo (Luyet & Hodapp, 1938). Tal fenômeno pode ser alcançado aumentando-se a concentração do agente crioprotetor de forma a evitar a formação de cristais de gelo durante a queda de temperatura, que se dá de forma muito rápida tanto no interior das células como na fase líquida remanescente (Pegg, 2005).
            Na vitrificação, o material biológico passa também por uma seqüência de soluções crioprotetoras contendo concentrações crescentes do crioprotetor. A maioria das metodologias atuais de vitrificação em reprodução assistida humana utiliza ferramentas diminutas que acomodam o embrião em volumes sub-microlitros. Diversas alternativas vêm sendo testadas procurando diminuir o volume da solução e aumentar a velocidade de resfriamento (Bos-Mikich et al, 2007; para uma revisão). Cada uma destas metodologias apresentou resultados satisfatórios em termos de sobrevivência dos embriões vitrificados, mas dúvidas quanto à praticidade dos protocolos, a repetitividade da metodologia e a segurança do material em tais sistemas abertos impedem seu emprego mais generalizado. O protocolo de maior sucesso em termos de viabilidade pós-aquecimento foi reportado por Kuwayama e colegas (2005) utilizando o dimetil-sulfóxido (DMSO) e o etilenoglicol como crioprotetores, além da sacarose e um sistema de cryotop para acomodar o embrião a ser vitrificado.
            De uma maneira geral, para a vitrificação são preparadas duas soluções, uma de equilíbrio (SE) e uma de vitrificação (SV) propriamente dita contendo crioprotetores em concentrações crescentes de até 15% do volume total. Os embriões são expostos gradativamente às soluções: cerca de 5-15 minutos à SE e por não mais do que 90 segundos à SV, ambas a temperatura ambiente.  Da SV, o material é transferido rapidamente ao recipiente onde será envasado e imediatamente imerso no NLiq. O grande desafio da vitrificação para obtenção de resultados bem sucedidos é o cuidado, a experiência e a destreza do embriologista, durante as etapas de exposição do material biológico às soluções contendo as altas concentrações do crioprotetor. Variações mínimas de poucos segundos de exposição além da adequada, especialmente na SV podem afetar a viabilidade do material e serem a maior causa de maus resultados alcançados em muitos laboratórios, em termos de sobrevivência do embrião, seu potencial de fertilização, implantação e gestação. Como no caso do congelamento lento, não é aconselhável vitrificar-se mais do que um embrião por vez, visto que a manipulação deve ser muito precisa e realizada em tempos específicos. Ainda, os mesmos cuidados devem ser tomados quanto a criteriosa identificação do material com os dados da paciente, antes do armazenamento nos botijões de NLiq.
            Para o re-aquecimento são também necessárias soluções de re-aquecimento contendo concentrações decrescentes de crioprotetor. O recipiente contendo o material biológico é removido do botijão de NLiq, exposto ao ar por 10 segundos, ao banho-maria a 37ºC por outros 10 segundos e deste à solução com o embrião é transferida para na 1ª solução de re-aquecimento. Após duas outras passagens por soluções contendo concentrações decrescentes de sacarose, o embrião é depositado em meio de cultivo e avaliado como no congelamento lento. Os critérios para a transferência dos embriões pós-vitrificação seguem os mesmos padrões descritos anteriormente.

Criopreservação de oócitos
            Uma alternativa para preservar a fertilidade de crianças e mulheres em idade reprodutiva submetidas a tratamentos oncológicos é a criopreservação de oócitos maduros, com o intuito de restabelecer a fertilidade da paciente, após o término do tratamento. A criopreservação do gameta feminino humano tem representado, entretanto, um verdadeiro desafio aos pesquisadores tentando estabelecer as melhores condições de resfriamento, concentração de crioprotetores e a velocidade de descongelamento ou re-aquecimento. Até a atualidade não existe um protocolo que possibilite a repetição bem sucedida em diferentes laboratórios de resultados relatados na literatura. Por não se tratar de uma técnica rotineira dentre os procedimentos de RAH, este assunto se limitará a alguns comentários sobre as metodologias empregadas com mais sucesso e os resultados alcançados pelos autores.
            Significantes ajustes nas diferentes metodologias de congelamento lento ou de vitrificação ao longo da última década já resultaram em diversas gestações levadas a termo. Existe uma tendência a crer-se que a melhor maneira de criopreservar o gameta feminino humano é a vitrificação. A mesma seqüência metodológica descrita anteriormente para vitrificação de embriões (Kuwayama et al, 2005) é a que vem apresentando resultados mais animadores em termos de sobrevivência do oócito pós-aquecimento, capacidade de fertilizar, de desenvolvimento embrionário, implantação e gestação.
            Para os oócitos, a integridade do oolema e do ooplasma pós-criopreservação são determinantes para decidir-se se eles serão ou não encaminhados à inseminação por ICSI.  Alterações na zona pelucida e no oolema causadas pelos processos de congelamento/descongelamento ou vitrificaçao/re-aquecimento desaconselham o uso da FIV para inseminação de oócitos pós-criopreservação, sendo, portanto, a ICSI o procedimento mais adequado para inseminação. Após a inseminação, o cultivo embrionário e seleção para transferência são idênticos aos apresentados anteriormente.