Artigo sobre criopreservação de sêmen de zebrafish é capa de revista internacional

A edição de abril de 2021 da revista científica Zebrafish dá destaque ao estudo realizado no Grupo de Pesquisa Aquam – Produção e Conservação da Biodiversidade das Espécies Aquáticas da UFRGS sobre criopreservação Protocolo de criopreservação consiste, de maneira geral, em expor as células a alguma solução crioprotetora com diferentes compostos (álcool, Metanol, DMSO, leite em pó e outros) e submetê-la a baixas temperaturas, a uma curva de congelamento. Se faz a criopreservação em botijão de nitrogênio líquido (menos 196 graus). Depois aquece, descongela e vê a viabilidade da célula para reprodução de sêmen de zebrafish O Danio rerio (zebrafish, paulistinha) é um pequeno peixe muito utilizado como modelo experimental para várias pesquisas, por apresentar características favoráveis, tais como alta fecundidade, pequeno tamanho, rápido desenvolvimento e curto intervalo entre gerações. Aproximadamente 71% de seu genoma é igual ao da espécie humana, por isso estudos realizados com o zebrafish podem ser translacionados para humanos . O artigo Oxidative Stress and DNA Damage of Zebrafish Sperm at Different Stages of the Cryopreservation Process, que é destacado na capa da publicação, é resultante da pesquisa de doutorado de Rômulo Batista Rodrigues no Programa de Pós-Graduação em Zootecnia. A tese “Criopreservação de sêmen de zebrafish”, defendida em 2020 e escolhida para representar o PPG na edição de 2021 do Prêmio Capes de Tese, aborda um tema importante não só para pesquisas que usam o zebrafish como modelo biológico, mas também para a redução de danos em processos de criopreservação de células de outras espécies, de mamíferos e até de humanos.

A tese de Rômulo é composta por três artigos científicos: o primeiro é uma revisão sistemática que faz um levantamento histórico e do cenário atual dos protocolos de criopreservação em zebrafish, apontando caminhos e limitações; o segundo apresenta uma avaliação de diferentes crioprotetores na criopreservação de sêmen de zebrafish, visando ao aprimoramento do protocolo; e o terceiro artigo trata da avaliação dos danos oxidativos e de DNA em diferentes momentos da criopreservação. Rômulo, que é zootecnista e atualmente realiza pós-doutorado no Aquam, já se dedicava ao estudo de outras espécies para produção de pescado e resolveu pesquisar o protocolo de criopreservação do sêmen do zebrafish, porque, segundo ele, não há estudos, nem mesmo para mamíferos ou humanos, sobre o que acontece na prole proveniente de sêmen criopreservado. Como o zebrafish tem alta homologia genética com o ser humano (cerca de 70% do genoma dele é igual ao nosso) e, por isso, é muito usado como modelo biológico em estudos de diversas áreas, a pesquisa sobre a criopreservação dessa espécie permite fazer inferências sobre o que pode ou não acontecer com filhotes de mamíferos, por exemplo. O pesquisador acrescenta que os resultados também são úteis para o trabalho com outras espécies de peixes no Aquam, tanto relacionados à aquicultura quanto à preservação de espécies em extinção. “Tendo o zebrafish como modelo, o protocolo que usamos nele pode ser testado em outras espécies para ver se funciona. É um modelo muito aceitável, que o mundo inteiro está utilizando. Há milhares de linhagens criadas em laboratório que precisam ser preservadas para futuros estudos, então a criopreservação é um método importante, mas os protocolos usados até agora ainda carecem de melhorias”, salienta Rômulo.

O grupo de pesquisadores reuniu os principais protocolos de criopreservação já publicados, os dois principais extensores usados e os principais crioprotetores e combinou todas as características desses protocolos para ver quais apresentariam o melhor resultado. Especificamente no artigo publicado na revista Zebrafish, é apresentada a pesquisa que procurou ver em qual momento ocorrem os principais danos resultantes do processo de criopreservação – se é a toxicidade do crioprotetor, ou seja, quando se coloca a amostra de sêmen em contato com ele – ou se é no congelamento mesmo, e então observar os danos oxidativos e de DNA nessas amostras. “O principal ponto do estudo é este, ver em que momento ocorre a maior parte dos danos, porque não se faz muito esse tipo de teste”, afirma Rômulo. O grupo identificou que o momento de congelamento/descongelamento das amostras é quando ocorrem os maiores danos aos espermatozoides e que a utilização de leite em pó desnatado na solução crioprotetora reduz os danos, aumentando o número de espermatozoides viáveis após criopreservação. Foi possível observar que a utilização de leite em pó diminuiu a geração de espécies reativas de oxigênio e a fragmentação de DNA, além de promover maior atividade antioxidante.

O leite em pó é um crioprotetor usado no processo de criopreservação há muitos anos, mas, conforme Rômulo, há pesquisadores que não indicam sua utilização, porque entendem que o produto acaba sujando a amostra, o que dificulta depois a análise das células. “Muitos pesquisadores relataram que o leite em pó não teria uma influência muito positiva na proteção dos espermatozoides e indicam não usar por dificultar a análise da amostra devido à sujidade, mas nós identificamos que é muito importante, principalmente na proteção aos danos de DNA. Quando se está pensando em fazer fertilização in vitro com esse espermatozoide e gerar novos indivíduos de zebrafish, devemos evitar a utilização de amostras que estão com DNA danificado, pois poderá influenciar no desenvolvimento da prole.”

Rômulo explica que o leite em pó é um tipo de crioprotetor externo, que funciona como uma camada de revestimento da célula que é congelada. “Muitos estudos não usam o crioprotetor externo, mas nós vimos que o leite em pó é fundamental, foi o que mais influenciou na proteção, então a nossa sugestão é essa: usar o leite em pó ou testar novos protetores externos, não permeáveis para a criopreservação de sêmen de zebrafish”, afirma. No estudo do Aquam, também foram usados dois crioprotetores internos, o metanol e o DMSO, e foi observado que não havia muita diferença entre eles. “O que mais influenciou no resultado foi usar ou não o leite em pó”, diz.

Embora os resultados obtidos até agora contribuam significativamente para o desenvolvimento de um protocolo de criopreservação mais preciso, Rômulo entende que ainda há muito a avançar. Um dos pontos importantes, na sua visão, é a avaliação sobre quais danos genéticos podem ocorrer na prole proveniente da fertilização de sêmen criopreservado. Segundo ele, estuda-se muito se o espermatozoide está viável ao fim do processo, mas ainda é preciso avançar sobre quais são os danos genéticos que podem ocorrer nessa célula, danos que não são observáveis no primeiro momento, mas que podem aparecer no futuro. Para isso, explica Rômulo, deve ser analisado o desenvolvimento embrionário e também da prole depois de nascimento. O seu projeto de pós-doutorado no Aquam é justamente este: avaliar o desenvolvimento da prole proveniente da criopreservação. Ele pretende concluir esse estudo até dezembro de 2021, realizando no Aquam a parte de criobiologia e usando laboratórios parceiros para avaliar a parte de comportamento e desenvolvimento da prole.