Confocal Olympus FV1000

PROFESSOR RESPONSÁVEL: Drª. Fátima Guma
TÉCNICO RESPONSÁVEL: Henrique Biehl Ramal: 7331 E-mail: confocal.cmm@gmail.com

Características do equipamento: O Microscópio Confocal FV1000 se destina, principalmente, ao estudo de amostras biológicas (in vivo e fixadas) fluorescentes (autofluorescentes ou marcadas). O microscópio também tem capacidade para fazer análises topográficas simples, por reflexão, em amostras sólidas, com pequeno aumento (10X e 20X). O microscópio está equipado com 4 lasers de fase sólida:

Lasers Excitação 1: 405nm – 2: 473nm – 3: 559nm – 4: 635nm

Preparação de amostras: A preparação das amostras deve ser feita pelo usuário, em seu laboratório, uma vez que o CME não dispõe de laboratório para preparação deste tipo de amostras.

Recomendações gerais:

1. A amostra deve ser coberta por uma lamínula (coverslip) – no caso de cultura, preparada sobre lamínula – de 0,17mm. Esta lamínula deve ser fixada à lâmina (pode ser utilizado esmalte para isso). As lâminas e lamínulas devem estar limpas e sem restos de esmalte ou meio de montagem.

2. Verificar a presença de autofluorescência na amostra e garantir que o sinal procurado seja superior a essa autofluorescência.

3. Preparar sempre uma lâmina somente com o anticorpo secundário (controle negativo), usando meio de montagem sem DAPI. Isso será especialmente importante em estudos de colocalização.

4. Escolha do Fluorocromo: Ao escolher os marcadores fluorescentes levar em consideração as linhas dos lasers disponíveis no equipamento.

Para marcações duplas ou triplas, fluoróforos devem ser excitados com linhas de lasers diferentes e os espectros de emissão devem ser bem separados e com o mínimo de sobreposição.- Além disso, levar em consideração a estabilidade do fluorocromo utilizado, tendo o cuidado de evitar os que sofrem photobleach rapidamente, principalmente se for necessário utilizar o eixo Z.

Usuários:– A utilização do microscópio confocal será realizada apenas por usuários credenciados no CME, autorizados pelos professores responsáveis pelos projetos cadastrados.- Pesquisadores, alunos de pós-graduação e professores da UFRGS poderão se credenciar como usuários qualificados. Alunos de Iniciação Científica deverão estar acompanhados por usuário creedenciado ou deverão ter prévia autorização do professor responsável pelo equipamento.- Usuários externos à UFRGS devem contatar a direção do CME.

Sessões de uso:– Cada sessão tem duração de 3 horas, sendo o microscópio operado pelo técnico responsável. São marcados turnos, correspondentes à manhã ou tarde.- Após a sessão o usuário deverá assinar o livro de registro.- A marcação de sessões deve ser feita por telefone na secretaria.- O agendamento de sessões será ccatalogado por projeto cadastrado.- Sessões devem ser necessariamente acompanhadas pelo usuário. Não é de responsabilidade do técnico conhecer a amostra e nem interpretar os resultados.

Considerações finais: Cada usuário deverá portar consigo uma imagem (artigo ou arquivo) do que deseja visualizar. O usuário deverá visualizar sua amostra previamente em um microcópio de fluorescência convencional para avaliar a qualidade de sua preparação . Amostras com muito background ou com marcação muito fraca não ficarão muito melhores no confocal. Limite o número de imagens ao mínimo necessário. Os arquivos gerados serão de responsabilidade do usuário: cada usuário terá um diretório no HD para arquivamento temporário, e deverá providenciar o backup dos arquivos para CD ou DVD. O prazo para backup é de 30 dias. Após este período os arquivos serão pagados sem aviso prévio. Lembre-se: o microscópio não está conectado à internet e está proibida a utilização de pen drive, portanto leve seu(s) CD/DVD (para imagens com eixo Z podem ser gerados arquivos muito grandes e pode ser necessário o uso de mais de um CD ou de um DVD).