QUÍMICA DE RADICAIS LIVRES

Embora no item anterior só tenhamos focalizado em radicais livres que contém oxigênio, existem um grande número de outros radicais nos sistemas vivos, como

Como os radicais livres reagem ?

A reatividade depende de qual radical está sendo estudado e com quem ele reage. Se dois radicais se encontram, eles reúnem seus e- desenparelhados e formam uma ligação covalente :

O exemplo biológico mais relevante desse tipo de reação é a rápida reação do óxido nítrico (NO· ) e superóxido (O_2· ^-) para formar um produto não-radicalar, o peroxinitrito.

Entretanto, o mais comum é a reação de um radical livre com um não-radical, já que a probalidade de dois radicais se encontrarem é baixa. Neste caso, um novo radical resulta e reações em cadeia podem acontecer:

1.Um radical (X^· ) pode adicionar-se a outra molécula. O aduto pode ainda ter um elétron desemparelhado.

Ex. OH^· adicionado a guanina no DNA, o produto inicial é um radical 8-hidroxiguanina que após reações pode formar a 8-hidroxi-guanina que é um composto altamente mutagênico.

2.Um radical pode atuar como um agente redutor (nem sempre temos uma oxidação, logo o termo oxidante para radicais livres não é quimicamente correto), doando um elétron para um não radical. O "recebedor" ficará com um elétron desemparelhado.

Ex. CO₂^{· -} reduz Cu ⁺ a Cu

3.Um radical pode ser um agente oxidante aceitando um elétron proveniente de um não-radical. O não-radical, então, terá um elétron desemparelhado e se tornará um radical.

Ex. O radical hidroxila oxida o sedativo prometazina a um radical catiônico.

4.Um radical pode abstrair um hidrogênio de uma ligação C-H. Como o H só tem um elétron o C se tornará um radical.

Ex. O radical hidroxila abstrai m H de cadeias laterais de ácidos graxos iniciando a peroxidação lipídica.

O que precisamos para entender a química de radicais livres é entender o potencial de redução, um parâmetro termodinâmico que determina o quão facilmente um composto X pode reduzir um composto Y. Um composto é dito auto-oxidável se sua forma reduzida pode ser oxidada por O₂. Potenciais de redução podem predizer quais compostos serão ou não serão auto-oxidáveis. Quando a auto-oxidação é termodinamicamente possível sua velocidade é lenta na ausência de catalisadores (geralmente metais de transição).

Para compreender melhor como se mede um potencial de redução vá para redox1 e redox2

Nos sistemas vivos os compostos redox não são separados por semi-células ligadas a pontes de sal. No entanto, o mesmo princípio se aplica: Um sistema com um E^o negativo reduz um sistema com um E^o menos negativo, zero ou positivo. Considere a Tabela 2, ela representa os valores de E^o para algumas espécies químicas biologicamente relevantes (os valores foram corrigidos para pH7,0 e então, são escritos E^o’).

Dados extraídos de Halliwell e Gutteridge (1999). Para cada par, a espécie oxidada está a esquerda e a espécie reduzida à direita.

No topo da lista temos o elétron hidratado (e^-_aq), formado na radiólise da água. Este pode reduzir qualquer espécie listada abaixo dele na Tabela. No final da lista temos o altamente oxidante radical hidroxila. Então, ele é termodinamicamente capaz de oxidar qualquer espécie acima dele na lista, isto é, ele pode roubar elétrons de qualquer um deles.

Esta Tabela é muito útil e pode ser usada para predizer a direção de reações. Veja, o sistema ascorbato/radical ascorbil é capaz de reduzir o sistema radical tocoferil/tocoferol porque este tem um E^o’ mais positivo. Lembra da nossa primeira aula, onde no software tu viste que a vitamina C recicla a vitamina E e não ao contrário? Aí está o motivo!

Similarmente, O₂^{· -} é capaz de reduzir quelatos de ferro,

Algumas reações são termodinamicamente improváveis. Assim, é improvável que o superóxido (E^o’= - 0,33V) reduza transferrina férrica a tranferrina ferrosa (E^o’= - 0,4V), mas ele pode reduzir o ferro da ferritina a Fe⁺² (E^o’= - 0,19 V).

Observações relevantes

O pH é um fator fundamental nas medidas dos potenciais de redução. Os valores da Tabela são corrigidos para pH 7, mas o pH nos diferentes órgãos, sistemas do corpo e compartimentos celulares pode variar muito. O suco gástrico tem pH> 2, enquanto o estroma de cloroplastos tem pH < 8. Além disso, uma reação mesmo termodinamicamente favorável pode não ocorrer porque a velocidade da reação

depende da temperatura, da concentração dos reagentes e da energia de ativação. Se esta é muito alta, a reação pode ocorrer muito lentamente ou não ocorrer.

Exemplo importante sobre constantes de Reação e Estresse Oxidativo

Sabemos que o radical hidroxila é o mais reativo dos radicais biológicos conhecidos. Sua formação, normalmente se dá pela reação do peróxido de hidrogênio (água oxigenada) com ferro ou cobre (a famosa reação de Fenton). Olhando as constantes de reação dadas abaixo, vemos que a reação com o ferro é muito mais lenta do que com o cobre.

Se igual concentração de Cu⁺ ou Fe⁺² é misturada com igual concentração de H₂O₂, a taxa inicial de formação do ^·OH será maior com o cobre num fator de 4,7 x 10³/ 76, isto é, 61,8 vezes.

Os valores das constantes podem ser aplicados a condições biológicas. A concentração intracelular de H₂O₂ e Fe⁺² é muito baixa. Se 1 mM (10^-6M)de H₂O₂ entrar em contato com 1 m M de Fe⁺², quanto radical hidroxila será formado?

Parece pouco, mas se lembrarmos que 1 mol contém 6,02 x 10²³ moléculas, o número de radicais formador por dm³ por segundo é de 4,58 x10¹³ !!!!!! Se o volume de uma célula varia entre 10^-12- 10^-11 dm³, isto significa 46-458 radicais hidroxil formados por célula a cada segundo !!!!

Não se assuste, em condições normais, o organismo não disponibiliza ferro livre que seja passível de reagir assim e o peróxido é rapidamente retirado de cena por enzimas antioxidantes (veremos adiante).

Química de radicais biologicamente importantes

1.Metais de transição

Quase todos os metais do bloco d na tabela periódica contém elétrons desemparelhados e podem ser classificados como radicais livres. A exceção é o zinco.

Ferro

O ferro tem dois números de oxidação mais comuns: Fe(II) e Fe(III) .

Espécies de ferro (IV) também existem, por exemplo, as espécies ferril-heme geradas na reação de proteínas com grupo heme (hemoglobina, catalase) com o peróxido de hidrogênio e espécies ferril envolvidas nas reações de peroxidases e citocromo P450.

Na presença de ar o ferro no estado (III) é mais estável, enquanto sais de ferro (II) são redutores fracos e compostos ferril são poderosos oxidantes. Se uma solução de sal de Fe(II) , como sulfato ferroso, é exposta ao ar, ela se oxida a ferro(III).

Essencial na dieta: deficiência causa anemia. É o metal de transição mais abundante no corpo humano. Tanto o excesso como a falta deste, no sistema, causam estresse oxidativo.

Cobre

O cobre tem dois números de oxidação: Cu(I) e Cu(II).

Essencial na dieta para enzimas como EC-SOD, CuZnSOD, citocromo oxidase, por exemplo. Tanto o excesso como a falta deste, no sistema, causam estresse oxidativo.

Metais de transição como catalisadores de reações de radicais livres

O número de oxidação variável permite que os metais de transição sejam eficientes catalisadores de reações e são usados no sítio ativo de muitas enzimas. O perigo potencial é que, se essas reações não forem bem controladas pelos organismos, os metais podem catalisar reações que geram radicais livres de forma descontrolada. Por exemplo, o organismo de mamíferos contém compostos auto-oxidáveis, tais como NADH, NADPH e tióis. Todos estes compostos são capazes de reduzir a molécula de oxigênio a radical superóxido. Felizmente, a velocidade destas reações é baixa. No entanto, metais de transição que estejam "disponíveis" podem catalisar estas reações e gerar dano em biomoléculas. O composto a que o metal está ligado é importante porque altera o potencial de redução do metal em questão. Por exemplo, Fe-EDTA tem um potencial de redução próximo a zero (Tabela) enquanto ferro ligado a transferrina é mais difícil de reduzir (-0,4V).

2. Radical hidroxil

Pode ser gerado por muitas reações:

a. .Reação de Fenton

b. Fissão homolítica do H₂O₂ por UVB

Isto pode acontecer a peróxido gerado na pele exposta ao sol.

Garotas, isto lembra alguma coisa?

c. Pelo ozônio

d. Pela radiação ionizante

e. Pelo ultrassom (não há dados que comprovem que esta formação seja significativa a ponto de prejudicar o tecido ou o bebê exposto).

2.1 Reatividade

O radical hidroxila reage rapidamente com todos os compostos celulares com constantes de reação na faixa de 10⁷- 10¹¹ M^-1 s^-1. Ele reage através de abstração de hidrogênio, adição em anéis aromáticos ou transferência de elétrons.

3. Radical carbonato

            Estes radicais são gerados a partir da reação de radicais hidroxil com íons de bicarbonato ou carbonato. Uma vez que o par CO₂/HCO₃^-é o constituinte do principal tampão fisiológico extracelular, a medida destes se torna m parâmetro importante nas análises de dano oxidativo.

            O radical carbonato também é um importante agente oxidante (E^0’=1,78) e oxida um grande número de macromoléculas, tais como cisteína, NADPH, ascorbato, metionina e guanina.

4. Superóxido

É bem menos reativo que o radical hidroxila (K₂ ~ 10¹M^-1 s^-1) com compostos não radicalares, mas reage rapidamente com outros radicais (NO^• ) e grupos Fe-S de enzimas.

4.1 Reatividade

Pode atuar como redutor (reduz a plastocianina, proteína do cloroplasto) ou como oxidante (oxida o ascorbato). Pode causar dano indireto por facilitar a geração de ^·OH através da reação de Fenton assistida ou de Haber-Wies.

Reação 1

A redução do ferro pelo superóxido permite que a reação continue:

Reação 2

Por fim, o resultado líquido das reações (1) e (2) é a chamada reação de Haber-Weiss

5. Radicais Peroxil e alcoxil

Em geral, radicais peroxil (RO₂^•) e alcoxil (RO^• ) são bons agentes oxidantes, tendo valores de E^o’ altamente positivos. Ambos os radicais podem abstrair oxigênio e essa reação é importante na peroxidação lipídica. Alguns RO₂^• podem liberar superóxido. Por exemplo, quando a glicose reage com radical hidroxila, 6 radicais peroxil diferentes são formados, uma vez que a abstração de H pelo radical hidroxila pode ocorrer em qualquer um dos grupos OH. Cinco destes grupos eliminam rapidamente superóxido.

Radicais peroxil também podem reagir entre si liberando oxigênio singlet.

6.Radicais de enxofre

In vivo, tiois (especialmente glutationa reduzida- GSH) são bons agentes oxidantes já que protegem proteínas com grupamentos -SH de oxidação e são sequestradores de radicais de oxigênio e algumas espécies reativas como o peroxinitrito. Há evidências de que o ácido sulfídrico (H₂S) é um sinalizador celular in vivo. No entanto, os tióis também podem gerar radicais livres.

Radicais tiil são formados quando tióis reagem com radicais centrados em carbono.

e com diversos radicais de oxigênio, incluindo hidroxila, peroxil,alcoxil e (em menor extensão) superóxido.

Os radicais tiil também podem ser gerados por reação com metais de transição.

E por fissão homolítica de dissulfetos , incluindo pontes dissulfeto de proteínas

            Tióis são instáveis em meio de cultura celular produzindo radicais e peróxido de hidrogênio. Seu uso nestas condições deve ser visto com cautela. 

7.Óxido Nítrico (monóxido de nitrogênio)

É um gás sem cor, moderadamente solúvel em água. Possui um e- desemparelhado no orbital pi* 2p, logo é um radical livre. Exposto ao ar o óxido nítrico reage com oxigênio formando o dióxido de nitrogênio, que é muito mais reativo.

Ele pode existir na sua forma protonada,HNO.

            Óxido nítrico como sequestrador de radicias livres.

            Por ter baixa reatividade com moléculas biológicas e alta reatividade com radicias livres, o NO tem sido analisado mais recentemente como um sequestrador de radicias livres, inclusive reagindo com o radical hidroxila.

            Sua habilidade de reagir com radicais RO₂^• o torna um poderoso inibitor da peroxidação lipídica. O NO também pode diminuir as propriedades pró-oxidantes de proteínas heme no caso de anemias hemolíticas, onde a hemoglobina é liberada para o plasma.

Papéis fisiológicos

Muitos dos efeitos fisiológicos do NO ocorrem como resultado de sua ligação ao Fe₂⁺ de grupos heme na enzima guanilato ciclase. Por exemplo, o óxido nítrico sintetizado pelas células do endotélio vascular que revestem o interior dos vasos sangüíneos, se difunde em todas as direções, mas aquelas moléculas que chegam as células musculares se ligam a esta enzima e a ativam. Como resultado GMP cíclico é produzido, o cálcio livre intracelular diminui e o músculo relaxa, dilatando o vaso e diminuindo a pressão sangúínea.

Síntese de NO

O NO é sintetizado a partir da arginina ou citrulina pelas óxido nítrico sintetases (NOS). O oxigênio é necessário e 4 cofatores (FAD, FMN, tetrahidropterina e heme), também. Cada tecido apresenta uma NOS específica, algumas são constitutivas e outras induzíveis. Há muita confusão na nomenclatura, ex. a chamada NOS endotelial ocorre em alguns neurônios e apesar de ser dita constitutiva pode ser induzida no endotélio. Outro dado interessante é que macrófagos de roedores produzem alta concentração de NO, enquanto em humanos só ocorre produção in vitro. Deve-se ter muito cuidado com extrapolação de dados de experimentos em roedores para humanos, neste caso!!!!

Química de compostos não-radicalares importantes

1. Peróxido de hidrogênio

É tóxico para células de mamífero em níveis de 10-100 µM. Ocorre no mel (papel bactericida). É estável em água e muito difusível. Provavelmente passa pela membrana plasmática através de aquaporinas.. É fraco oxidante e fraco redutor. O dano biológico gerado por ele ocorre pela reação de Fenton.

Diversas enzimas geram peróxido de hidrogênio, incluindo xantina, urato, glicose, monoamina e D-amina oxidases, assim como a SOD. O ascorbato e alguns flavonóides oxidam-se em meio de cultura gerando peróxido de hidrogênio, o que pode levar a artefatos experimentais.

Sua reatividade é baixa e danos diretos a biomoléculas são de menor relevância. A sua participação na produção de radical hidroxila, a partir da Reação de Fenton, é que lhe confere uma característica de forte indutor de dano oxidativo. Também apresenta um papel fisiológico estando envolvido em divisão celular através de vias de transdução de sinal.

2. Ácido Hipocloroso (HOCl)

É produzido pela mieloperoxidase em neutrófilos. É um ácido fraco. Em pH 7,4, encontra-se 50% na sua forma ionizada (hipoclorito). Lembram da clorofina ou água sanitária? É um poderoso oxidante. Pode oxidar tióis, NAD(P)H e "clorinar"bases de DNA e resíduos de tirosina. Atravessa membranas, causando danos em proteínas de membrana. Pode reagir com o radical superóxido ou ferro gerando radical hidroxila.

3. Oxigênio singlet

Seu tempo de vida em água é de 3,8 ms. É gerado por reações de fotosensibilização. Nesta reação certas moléculas ao absorverem luz passam a um estado excitado, esta energia excedente pode ser transferida a uma molécula de oxigênio adjacente, convertendo-o ao estado singlet. O oxigênio singlet pode reagir com outras moléculas (efeito fotodinâmico). Manchas na pintura de carros expostos ao sol ocorrem por este efeito. Além do dano direto pelo oxigênio singlet, a própria molécula que foi sensibilizada também pode causar danos.

Estas reações de fotosensibilização ocorrem nos cloroplastos devido a presença da clorofila e de abundância de oxigênio. O retinal (derivado da vitamina A) presente na retina também pode gerar oxigênio singlet ao ser iluminado por altas intensidades de luz, levando a danos.

Animais ruminantes absorvem e excretam pela bile a filoeritrina, produto da digestão da clorofila. Se há mal funcionamento hepático, este composto é depositado nos tecidos e leva a feridas na pele se expostos ao sol (relativamente comum ser observado em bovinos próximo ao nariz e olhos).

Há dados de dermatites em indivíduos orientais que ingerem grandes quantidades da alga Chorella e o dano é atribuído a um derivado da clorofila.

Um consumo exagerado de Hipericum (erva de São João), que é um antidepressivo fitoterápico, pode ter um efeito semelhante.

E o consumo do suco de clorofila?

4. Peroxinitrito

É formado a partir da reação do óxido nítrico com o radical superóxido.

A sua forma protonada é um poderoso oxidante com um potencial de redução próximo ao do radical hidroxila. Pode levar a quebra de DNA, nitração e desaminação de bases e proteínas.

5. Ozônio

Ozônio é um irritante, gás triatômico não radical livre, pouco solúvel em água. Exerce uma função antioxidante muito importante filtrando os raios UV,na atmosfera. É produzido através da fotodissociação do O₂ em átomos de oxigênio, que por sua vez são combinados com o O₂.

Mas o O₃ não é totalmente benigno, induz inflamação, ativando macrófagos pulmonares e recrutando neutrófilos para o pulmão. Espécies reativas produzidas nestas células são uma fonte adicional de estresse oxidativo após a exposição ao O₃. Ele oxida proteínas e lipídios, e também causa dano as plantas e a pele.